Izolacja fitopatogennych grzybów na czyste kultury

Jak zauważył N. A. Naumov (1937), zestaw metod izolowania i hodowli grzybów różni się w szerokim zakresie w zależności od celu badań. Jednak koncepcja eksperymentów pasuje do jednego systemu. Przed uzyskaniem badanego grzyba w czystej kulturze konieczne jest posiadanie tkanki zarodnikowej lub grzybni, wolnej od infekcji mikroflorą nabłonkową, która czasem zniekształca obraz, komplikuje identyfikację i izolację dotkniętych tkanek.

Jedną z najprostszych metod uzyskiwania grzybni lub organów zarodnikujących (w tym wielu pasożytów obligatoryjnych) jest stosowanie tzw. mokre komory. Zwykle stosowane do ich produkcji. szalki Petriego lub Kokha. Dno miseczek i wewnętrzna powierzchnia pokryw są wyłożone kółkami bibuły filtracyjnej o odpowiedniej średnicy, sterylizowane w temperaturze 110 ° C przez dwie godziny i zwilżone sterylną wodą. Małe części badanych tkanek w ilości 3-10 próbek po sterylizacji powierzchniowej układane są na dnie miseczek bezpośrednio na bibule filtracyjnej równomiernie na jej powierzchni.

Powierzchniową sterylizację części chorych tkanek można przeprowadzić za pomocą płomienia palnika alkoholowego (płonącego), strumienia wody lub specjalnych chemikaliów. Metoda sterylizacji powierzchni naturalnego podłoża jest odpowiednia do drewna, korzeni, nasion lub owoców. Im bardziej obszerny jest sterylizowany przedmiot, tym dokładniej i dłużej można go ogrzać, bez obawy o żywotność grzybni wewnątrz tkanek.

Czasami konieczne jest odizolowanie patogennego grzyba od częściowo rozłożonego materiału lub błotnistych części rośliny (periterapia strupu na opadłych liściach itp.) W takim przypadku obiekt testowy umieszcza się na drobnym sicie i myje przez kilka godzin pod bieżącą wodą.

Następnie materiał pobrany do badań jest dodatkowo czyszczony i dezynfekowany z powierzchni przez zanurzenie w jednej z następujących substancji: 96- lub 50-ty alkohol na 2-3 minuty - roztwór chlorku rtęci (0,1-ty) z ekspozycją od kilku sekund do trzech minut- 0,5-1,0 roztwór nadmanganianu potasu (do 20 min) - sklarowany roztwór wybielacza (1) - 0,1-1,0 roztwór wody bromowej (kilka sekund) lub roztwory innych środków dezynfekujących a następnie mycie w sterylnej wodzie. W tym celu można zastosować roztwór formaliny 1: 300, a następnie osłabić przedmiot w naczyniu z jego parą od 30 minut do 2 godzin.

Badania grzybów rozwijających się w mokrych komorach należy przeprowadzać bezpośrednio w miseczkach przy małym powiększeniu mikroskopu w świetle przechodzącym lub odbitym..

Po pojawieniu się sporulacji lub oznak rozwoju grzybni jest ona hodowana na pożywce agarowej bezpośrednio do probówki na skośny agar lub wcześniej na pożywce agarowej rozlanej na szalkach Petriego. Obowiązkowe pasożyty są hodowane na żywych roślinach lub specjalnych środowiskach.

Do dalszej pracy bardzo ważne jest oczyszczenie kultury. Odbywa się to za pomocą okablowania, rozcieńczenia w sterylnej wodzie lub za pomocą probówek.

1. Niewielką ilość grzyba pobiera się na pętlę hodowlaną i rozprowadza na powierzchni agaru na płytkach Petriego. W miarę przedłużania się skoku zarodniki są coraz bardziej dzielone, aż w rezultacie pojedyncze kolonie powstają z kilku lub pojedynczych zarodników.

2). Zarodnik inokulum umieszcza się w probówce ze sterylną wodą (10 ml), a następnie pewną ilość zawiesiny (na przykład 1 ml) przenosi się sterylną pipetą do probówki z 9 ml sterylnej wody. Świeżą sterylną pipetę stosuje się do zmieszania płynu i przeniesienia 1 ml do następnej probówki zawierającej 9 ml sterylnej wody. Hodowla trwa w razie potrzeby. Takie dziesięciotysięczne rozcieńczenie ma pewne zalety w porównaniu z okablowaniem deski rozdzielczej. W końcowym rozcieńczeniu 1 ml zawiesiny zarodników dodaje się do stopionego agaru, schładza do około + 40 ° C..

3). Wziąć pięć probówek odpowiedniego podłoża agarowego, stopić i ostudzić do + 45 ° C. Następnie do jednej z probówek wprowadza się niewielką ilość zarodników - rurkę przewija się między dłońmi, a zawartość wlewa się do szalki Petriego. Pustą probówkę napełnia się ponownie z innej probówki stopionym medium, przewija się między dłońmi i wlewa do drugiej filiżanki. Tę procedurę powtarza się z pozostałymi trzema probówkami..

Prowadząc badania teoretyczne lub analizując populację dowolnej formy geograficznej, konieczne jest uzyskanie kultury z jednego sporu. Prawie monosporową hodowlę wielu grzybów uzyskuje się w następujący sposób.

1. Słabą zawiesinę zarodników przygotowuje się na sterylnym szkiełku szklanym w sterylnej wodzie przez zanurzenie kalcynowanej zwilżonej pętli w hodowli sporulującej. Zawiesinę zarodników rozprowadzono pasmem na szalce Petriego na bardzo cienkiej płytce agarowej przygotowanej we wrzącej wodzie i utrzymywanej w temperaturze + 24 ° C. Jeśli odbywa się to w 16-17 godzinach, to w 9-10 godzinach następnego dnia zwykle obserwuje się początek kiełkowania i gotowość przetrwalników do izolacji.

Podczas pracy z lornetką (mikroskop stereoskopowy) płytkę Petriego przesuwa się wzdłuż linii znaku i wybiera się odpowiednie kiełki. Odpowiednia igła wykonuje wycięcie w hangarze około 2 mm wokół zarodnika. Kwadrat i obszar bezpośrednio wokół niego są sprawdzane pod małym powiększeniem mikroskopu biologicznego, aby upewnić się, że jest tylko jeden zarodnik.

Wróbelowy blok agarowy przenosi się następnie sterylną igłą pod lornetkę na płytce lub probówce agarowej.

2). Pożywkę wlewa się cienką warstwą do sterylnych szalek Petriego, następnie pobiera się probówkę ze sterylną wodą i wprowadza do niej niewielką ilość zarodników testowych grzybów i dokładnie wytrząsa z wodą. Następnie 4-5 kropli zawiesiny zarodników pobiera się metalową pętlą i przenosi na szklany szkiełko. Pod mikroskopem zliczana jest liczba zarodników w każdej kropli. Jeśli spadek kończy się średnio n zarodniki, sterylna woda jest dodawana do probówki, aby zwiększyć jej objętość n+1 raz.

Co więcej, możemy założyć, że w jednej kropli będzie średnio jeden spór. Następnie z probówki z rozcieńczoną zawiesiną zarodników pobiera się 3-4 krople i przenosi na szalki Petriego na pożywce agarowej. Krople powinny być oddzielone od siebie w stosunkowo dużej odległości. Pod mikroskopem sprawdź liczbę zarodników wchodzących w każdą z tych kropli. Oglądanie odbywa się z dołu kubka, który jest do tego starannie odwracany. Jednocześnie są one wybierane z kropelek, w których znajduje się jeden zarodnik, i są zaznaczone na szkle ołówkiem woskowym. Kolonie uzyskane na płytkach Petriego przeszukuje się w skośnych probówkach z agarem.

Czasami kroplę zawiesiny zawierającej jeden zarodnik umieszcza się na sterylnym szkle na szalce Petriego i dodaje do niej kawałek podłoża agarowego - po zarośnięciu grzybnią grzyb przenosi się na probówkę lub płytkę Petriego.

3). Hansen (H. R. Hansen, 1926) użył cienkich szklanych naczyń włosowatych, obniżonych zawiesiną zarodników do ciepłego podłoża agarowego. Kapilary te zbadano następnie mikroskopowo i pocięto na kawałki, z których każdy zawierał jeden zarodnik. Takie kawałki następnie poddano sterylizacji powierzchniowej i umieszczono na płytce agarowej.

Możesz użyć innych metod otrzymywania kultur monosporowych, które są wskazane w literaturze (na przykład metoda „suchej igły” Hannah i inne). Tak więc, aby uzyskać hodowlę monospor z uredospor, rdze zbóż strząsa się na suchym szkiełku. Następnie, przy końcu wyciągniętego szklanego pręta, jeden zarodnik jest oddzielany pod lornetką lub przy niewielkim powiększeniu mikroskopu. Koniec sztyftu jest wstępnie wycierany wacikiem zwilżonym spirytusem metylowanym lub alkoholem. Wybrany zarodnik przenosi się w kropli wody na liść rośliny. Takie manipulacje przeprowadza się około 200 razy, pamiętając, że wskaźnik przeżycia wynosi zwykle 6-10.

Podczas izolowania hodowli jednopodułowej grzyba przeprowadza się wstępne rozmnażanie populacji rdzy, aby na liściach powstały pojedyncze uredopustule. W tym celu do zaszczepienia wykorzystuje się niewielką ilość zarodników..

Po otrzymaniu początkowych krost w wyniku monosporowej lub monopięśniowej kultury grzyba, zaczynają namnażać w nich zarodniki na niektórych odmianach, powtarzając 2-3 razy proces rozmnażania roślin przez dobrze rozwinięte uretropody. W rezultacie gromadzi się wystarczająca ilość inokulum do dalszej pracy z nim.

Izolacja czystych kultur z różnych narządów i tkanek ma swoje własne cechy. Po powierzchownym uszkodzeniu owocu zewnętrzną uszkodzoną warstwę zeskrobuje się, a grzybnię kiełkuje w wilgotnej komorze, a następnie ponownie wysiewa kolonię na podłożu agarowym. Poprzednio dotknięta powierzchnia jest dokładnie myta sterylną wodą..

Podczas izolowania kultur od wewnętrznych części płodu są one dokładnie myte, dezynfekowane w chlorku rtęciowym (1: 100) przez 5 minut, a następnie ponownie myte w sterylnej wodzie, kawałki owoców wycięte z tkanek wewnętrznych sterylnym skalpelem są umieszczane na agarze odżywczym.

Podczas izolowania patogenów, które powodują zewnętrzne uszkodzenie korzeni, użyj techniki opisanej dla owocu. W przypadku zmian wewnętrznych korzenie są dokładnie myte, płomieniowane, a następnie wykonuje się przekroje poprzeczne lub podłużne. Powstałe małe kawałki wewnętrznej chorej tkanki kiełkują na pożywce agarowej..

Izolacja grzybów z liści, płatków i innych delikatnych organów wiąże się ze znanymi trudnościami, ponieważ w tym przypadku prawie trzeba porzucić sterylizację powierzchniową za pomocą substancji chemicznych, które mogą wpływać na grzybnię patogenną w mezofilu. Aby zwiększyć dokładność i niezawodność selekcji, powinieneś używać możliwie najmniejszych części tkanek, jednocześnie zwiększając ich całkowitą liczbę.

Grzyby, które infekują korę i drewno (tchawiczość, zgnilizna, martwica), można izolować bezpośrednio z dotkniętej tkanki przez wysianie powierzchniowo sterylnych kawałków lub plasterków na pożywki hodowlane lub z zarodników i grzybni uzyskanych w wilgotnej komorze. Drewno i kora powinny być świeże, ponieważ grzyby pleśniowe rozwijają się w starzejących się okazach, które zatykają plony..

Zainfekowane drewno dezynfekuje się przez zanurzenie na kilka minut w 95% alkoholu lub 0,5% roztworze nadmanganianu potasu, a następnie płonie. Następnie części powierzchni próbki są cięte sterylnym skalpelem lub mikrotomem, a płytki od kilku mikronów do grubości 5-10 mm są wycinane od wewnątrz i przenoszone na pożywkę.

Podczas izolowania kultury od ciałek błonkoskrzydłych najpierw warstwa powierzchniowa jest cięta, a małe kawałki o średnicy 4-5 mm są wycinane od wewnątrz nośnika owoców i zanurzone w połowie w agarze odżywczym. Następnie rozwinięta grzybnia jest przenoszona na skośny agar.

Aby wyizolować endogenną grzybnię z młodych sadzonek, dotknięte nią części nie są sterylizowane, ale tylko myte, aby ich nie zabić - materiał jest lekko trawiony i umieszczany na agarze odżywczym lub w wilgotnej komorze - powstająca grzybnia jest szybko oddzielana, starając się zapobiec wzrostowi saprofitycznych mikroorganizmów.

Starsze sadzonki dezynfekuje się w 0,5% roztworze nadmanganianu potasu, myje wodą i umieszcza w wilgotnej komorze, skąd rozwinięta grzybnia jest przenoszona na pożywkę. Możliwe jest również zastosowanie odcinków łodygi, które są ułożone na agarze, aby wykiełkować grzybnię grzybów chorobotwórczych.

Mikroflora chorych nasion jest zwykle analizowana po rozwoju w hodowli na pożywce (M. M. Samutsevich, 1931). W tym celu pobiera się całkowitą próbkę z partii nasion z różnych miejsc, zlicza się 200 nasion i 25 sztuk umieszcza się na płytkach Petriego na podłożu agarowym.

Podczas określania infekcji powierzchniowej nasiona nie są sterylizowane; w celu ustalenia głębokiej infekcji są one przechowywane w nadmanganianu potasu (0,5) przez 2-3 minuty lub zanurzone w czystym alkoholu przez 1 minutę.

W niektórych przypadkach zdezynfekowane nasiona są cięte na dwie części za pomocą sterylnego skalpela. Mocno zmumifikowane nasiona wstępnie inkubuje się na bibule filtracyjnej zwilżonej sterylną wodą; po wysuszeniu i podpaleniu umieszcza się je na płytkach Petriego. Gdy pojawia się zarodnikowanie patogenu, przenosi się je na skośny agar.

Po wyodrębnieniu czystej kultury grzyby są wstępnie hodowane na lekko zakwaszonym podłożu agarowym lub żelatynie (N. A. Naumov, 1937). Podczas początkowej izolacji patogenu nie można stosować płynnych lub silnie zwilżonych pożywek, ponieważ przyczynia się to do rozwoju drobnoustrojów saprofitycznych. Nie należy również siać grzybów chorobotwórczych na stałym pożywce: ryż, ziemniaki, chleb i inne produkty.

Aby zidentyfikować patogeny, które utrzymują się w glebie, w celu ich późniejszej izolacji pobiera się próbki z charakterystycznych różnic w glebie (podzol, czarnozem, serozem itp.) Na różnych głębokościach od niektórych upraw itp. Podczas pobierania próbek sekcja gleby jest następnie jałowa narzędzie oddziela pożądaną warstwę, z której pobiera się próbkę 10-20 g, umieszczając ją w sterylnym naczyniu lub kopercie. Zaleca się zabranie gleby z górnej stojącej (do 3 cm) i głębiej, na poziomie lokalizacji głównej masy korzeni. Aby w pełni scharakteryzować teren, konieczne jest uzyskanie informacji o poprzednich uprawach i kwasowości gleby (pH) w ciągu trzech lat.

Podczas badania rozmieszczenia infekcji na polu wykopywane są doły glebowe co 5 m na jednolitym obszarze; do badań rozpoznawczych wystarcza 5-10 dołów glebowych na sekcję.

Zebraną glebę suszy się przez kilka dni do stanu suchego w papierowych kopertach, kruszy i wysiewa na pożywce agarowej za pomocą sterylnej szpatułki, skalpela i innych narzędzi. Każdą próbkę (10–20 g) rozprowadza się na 6-7 szalek Petriego, następnie płytki są trzymane w termostacie w temperaturze 20–25 ° C i okresowo przeglądane. W miarę rozwoju kolonii grzybów przenosi się je na ukośny agar w probówkach. Obecność izolowanych grzybów określa się konwencjonalnymi metodami. Po 7-8 dniach od początku wzrostu kolonii kubki stają się nieodpowiednie do badań przesiewowych grzybów z powodu zanieczyszczenia środowiska przez saprofityczne mikroorganizmy.

Badanie grzybów glebowych-mikromycetes jest możliwe poprzez izolację ich w czystej kulturze lub przy użyciu metody „płytek porastających”, mikrokamer glebowych, pedoskopów wykonanych z bardzo cienkiego szkła i innych technik.

Izolacja mikroorganizmów, w tym fitopatogennych grzybów, w żywotnym stanie z wody i powietrza jest przedmiotem specjalnych badań. Istnieją różne metody analizy z wykorzystaniem próbników, automatycznych wolumetrycznych i bezwładnościowych pułapek na zarodniki (F. Gregory, 1964-Yu. P. Bochkov, A.I. Voronova, V.F. Dumsky, 1966- A.I. Klochko, 1969 itp. .).