Pożywki i zachowanie kultur fitopatogennych patogenów

Dla czystych kultur grzybowych - fakultatywne saprofity i fakultatywne pasożyty, zachowując ich żywotność do celów dalszych badań, stosuje się różne pożywki. Media te rozróżnia się między ciałem stałym a cieczą o znanym i nieznanym składzie chemicznym, naturalnym i sztucznie przygotowanym. Wybór określonego rodzaju podłoża pokarmowego zależy od potrzeb organizmu grzybowego i celów badania. Na przykład, badając odporność rośliny w celu oceny odporności rośliny żywicielskiej na toksyczne substancje patogenu i wpływ jej uwalniania na wzrost patogennych form, konieczne jest uzyskanie obfitej sporulacji.

Poszczególne media są wybierane w procesie eksperymentalnym. Grzyb wysiewa się jednocześnie na różnych podłożach pośrodku szalek Petriego (w trzech egzemplarzach) i utrzymuje w temperaturach optymalnych do jego rozwoju. Obserwacje prowadzone są przez 12-15 dni nad wzrostem i rozwojem grzyba (energia wzrostu, początek i charakter sporulacji, gęstość grzybni itp.), W wyniku czego wybiera się najbardziej odpowiednią pożywkę. Podczas korzystania ze standardowych środków syntetycznych ich skład można zmienić, dodając i wykluczając różne składniki chemiczne.

Często istnieje potrzeba znalezienia środowiska, w którym grzyb rośnie i rozwija się lepiej niż w naturze. Można to osiągnąć dzięki temu, że po sterylizacji w środowisku mikroorganizmy konkurujące są niszczone, a ich substancje składowe ulegają głębokim zmianom biochemicznym, które przyczyniają się do lepszego wchłaniania przez niektóre grzyby. Zwykle są to podłoża agarowe z wywarkiem lub naparami (wyciągami) z rośliny żywicielskiej lub łodyg koniczyny. Tak więc 100 g świeżych lub 50 g suszonych narządów, które karmią rośliny grzybowe, pobiera się w 1 litrze wody. Masę kruszy się, gotuje przez godzinę, przywraca pierwotną objętość cieczy, filtruje, po czym dodaje się 2-2,5 agar-agar, rozpuszcza i sterylizuje (M.K. Khokhryakov, 1969).

Podczas uprawy grzybów pasożytujących na drzewach drzewnych I.I. Miikevich zastosował naturalne pożywki przygotowane zgodnie z tym przepisem. Drobno posiekane gałęzie niektórych gatunków drzew (200 g) wlano do wody (1 l) i trzymano przez 12 godzin w temperaturze 80 ° С, po czym infuzję przefiltrowano i dodano agar-agar (2.5). Następnie pożywkę sterylizowano przez dwie godziny za pomocą płynnej pary w aparacie Kocha. W specjalnych badaniach przygotowano ekstrakty z różnych odmian, które wyrównano pod względem stężenia (1 pod względem suchej masy) przez kolejne rozcieńczanie. Możliwe jest stosowanie podobnych naturalnych środowisk w większym stężeniu.

W przypadku niektórych systematycznych grup grzybów chorobotwórczych wielu badaczy wybrało naturalne substraty odżywcze i zidentyfikowało podłoża o znanym składzie chemicznym. W ten sposób eksperymentalnie ustalono, że ten gatunek z tego rodzaju Fusarium dobrze rosną na gotowanych ziarnach ryżu - grzybach z rodzaju Piricularia rozwinąć obfite zarodnikowanie na pożywce agarowej z wywarkiem z ziarna pszenicy lub roślin okopowych z marchwi. Skład stałych pożywek dla poszczególnych gatunków i grup grzybów pokazano w tabeli 20.

Przygotowując medium, należy pamiętać o następujących okolicznościach:

1. grzyby zwykle rosną lepiej w środowisku bogatym w węglowodany, ale hodowla ich na takich podłożach może zmniejszyć sporulację przez długi czas-
2. większość grzybów preferuje lekko kwaśną reakcję (pH 6,0-6,5), podczas gdy bakterie wolą obojętne (pH 7,0) lub lekko alkaliczne-
3. węglowodany i białka w roztworach kwaśnych i zasadowych ulegają zniszczeniu po podgrzaniu, dlatego należy je umiarkowanie sterylizować lub dodawać osobno-
4. agar rozpuszcza się w połowie normy wody na 1-2 godziny, a składniki odżywcze w pozostałej wodzie, po czym składniki są mieszane-
5. agar nie twardnieje w środowisku bardzo kwaśnym lub zasadowym-
6. pepton można głównie wykluczyć z pożywki dla grzybów-
7. przegotowaną wodę należy preferować destylowaną, ponieważ pierwsza zawiera użyteczne pierwiastki śladowe dla grzybów z rodzaju Phytophthora lepiej użyć wody destylowanej-
8. w przypadku podłoży zawierających materiał roślinny jest on wstępnie pobierany w niskiej (agar ziemniaczany) lub wysokiej (agar ziemniaczano-dekstrozowy).

W niektórych przypadkach (podczas badania toksycznych wydzielin patogenów, enzymów itp.) Stosuje się płynne pożywki. Na przykład toksyczne działanie wydzielin Deuterophoma tracheiphila badano go na podłożu przygotowanym przez naleganie na zmielone pędy rośliny żywicielskiej (200 g pędów na 100 cm3 wody). W przypadku grzybów smut zaleca się następujący skład: 0,03 g K2S04 - 0,01 g NH4NO3 - 10,0 g dekstrozy (lub maltozy) - 0,01 g CaCl2 - 0,01 g Mga (P04) 2-4H20 i woda 100 cm3.

W przypadku różnych badań dotyczących biologii grzybów i odporności roślin pojawia się potrzeba długoterminowego przechowywania czystych upraw. Jednak po przechowywaniu wiele patogennych grzybów zmienia charakter morfologiczny i kulturowy, a czasami traci właściwości patogenne. Dlatego przed przeprowadzeniem eksperymentów z grzybami pobranymi po długotrwałym przechowywaniu w czystej kulturze konieczne jest przywrócenie ich chorobotwórczości poprzez przeprowadzenie przejść przez roślinę żywicielską.

Skład pożywek dla rosnących fitopatogennych grzybów

Powszechnym sposobem na utrzymanie czystych kultur grzybowych jest ich okresowe wysiewanie na świeże pożywki. Większość upraw przesadza się 2-3 razy w roku. Podczas przesadzania przenoszone są głównie zarodniki, aw formach nie tworzących zarodników grzybnia ze strefy brzeżnej kolonii.

Sadzenie odbywa się w dwóch powtórzeniach, a 3 kopie każdej kultury grzybowej pozostawia się do przechowywania, liczenia i ponownego posiewania poprzedniego terminu. Jeden z nowych wysiewów służy wyłącznie do przyszłego wysiewu, drugi - do badań przesiewowych podczas prac eksperymentalnych.

Do długotrwałego przechowywania grzybów lepiej jest używać bezcukrowej skrobi i mediów celulozowych. Wiele grzybów półsaprofitycznych jest dobrze zachowanych na sterylnym naturalnym materiale (na przykład grzyby z rodzaju Cytospora na gałęziach rośliny żywicielskiej) - w tym przypadku najbardziej odpowiednia jest temperatura 4-5 ° C. Głębokie chłodzenie (około - 20 ° С) w zadowalający sposób utrzymuje żywotność grzybów przez bardzo długi okres.

Kultury grzybów można również konserwować pod olejem mineralnym, po liofilizacji (liofilizacja pod zmniejszonym ciśnieniem) i pod ciekłym azotem w ampułkach. Jeśli grzyby będą w stanie wytrzymać pełne przetwarzanie, będą żywe przez 10 lat lub dłużej. Jednak stosowanie tych metod wymaga uciążliwego i kosztownego sprzętu..

W normalnych warunkach zbieranie grzybów najlepiej przechowywać w szerokich probówkach w ukośnym podłożu wzrostowym, zamkniętym bawełnianymi zatyczkami. Uważaj jednak na uszkodzenia upraw przez kleszcze (gatunki siły roboczej) Tyroglif i Tarsonemus), szczególnie w regionach południowych i latem w klimacie umiarkowanym. Wchodząc do probówki, kolb i szalek Petriego, jedzą rośliny, zakażają je bakteriami i zanieczyszczają.

Istnieje wiele sposobów radzenia sobie z tymi roztoczami. Ale przede wszystkim należy przestrzegać ogólnej higieny, podejmować środki, aby owady nie latały do ​​laboratorium, zachować ostrożność podczas pracy z materiałem organicznym i glebą. Wszystkie nowe materiały muszą być dokładnie sprawdzone przy odbiorze. Jeśli to możliwe, powinny być dostępne osobne pokoje na czysty i brudny materiał..

Wystarczająco gęste bawełniane zatyczki są zwykle nieprzepuszczalne dla kleszczy, a dopływ powietrza do hodowli nie jest zakłócany. Dla większej gwarancji korki można leczyć truciznami, które mają szkodliwy wpływ tylko na kleszcze. Zalecane jest również użycie bibuły. W tym celu po zatkaniu krawędzi korka palą się w płomieniu palnika i pokrywają go lepką ciepłą żelatyną siarczanem miedzi (siarczan miedzi - 20, żelatyna - 20, woda - 60). Ta powłoka jest następnie mocowana na końcu rurki bibułką. Po wyschnięciu nadmiar papieru jest spalany. Taki papier jest bardzo cienki z porami, które zapobiegają przenikaniu roztoczy, zapewniając dostęp powietrza. W ten sam sposób można zatkać kolby, ale gumowe zatyczki należy usunąć, a bibułkę wysterylizować przed użyciem..

Przydatne jest również zamknięcie wszystkich kolb, kubków i rurek zanieczyszczonym materiałem po otrzymaniu papieru.

Wszystkie kultury powinny być ponumerowane i zarejestrowane na specjalnych kartach, które odnotowują numer i nazwę kultury, gdzie i gdzie została przydzielona, ​​datę przydziału, metodę izolacji, nazwę podłoża stosowanego do ponownego posiewu, wyniki obserwacji wzrostu patogenu w czystej kulturze i odnotowano cechy.