Metody inokulacji roślin

Przed przystąpieniem do zaszczepiania roślin należy je przygotować. Powinny być wolne od infekcji, oczywiście zdrowe. W tym celu rośliny doświadczalne najlepiej hodować ze zdrowych nasion w szklarni lub domu w doniczkach (doniczkach) wypełnionych ziemią wolną od infekcji. Nasiona przed siewem są dezynfekowane konwencjonalnymi środkami do zaprawiania, a gleba jest autoklawowana pod ciśnieniem 1-2 atm.

Podczas uprawy rośliny podlewa się bez zwilżania powierzchni liści i łodyg (woda wlewa się bezpośrednio na glebę lub przez specjalnie włożone rurki). Jeśli to możliwe, należy wykluczyć obce lub przypadkowe zakażenie przenoszone przez owady lub powietrze.

Jeśli nie można uzyskać roślin doświadczalnych w eksperymencie szklarniowym z nasion, rośliny rosnące w stanie dzikim są pobierane i przesadzane do doniczek, po czym są trzymane w szklarni przez co najmniej jeden (najlepiej 1,5-2,0) okres inkubacji choroby spowodowane przez badanego grzyba. Praktycznie do tego wystarczy 7-10 dni.

Podczas zaszczepiania roślin grzybami na polu konieczne jest wstępne odizolowanie wyznaczonych organów naziemnych od środowiska za pomocą oszklonych drewnianych ram, czapek papierowych, toreb plastikowych, szkła nietoperzowego lub lamp lampowych - te ostatnie są przywiązane do słupków, a górne i dolne otwory są zamknięte wacikami . Taka wstępna izolacja przez okres 1-2 okresów inkubacji jest konieczna w celu zweryfikowania naprawdę zdrowego stanu eksperymentalnych narządów roślinnych. Ponadto we wszystkich przypadkach starają się zapewnić, aby izolowane rośliny lub ich narządy rozwijały się normalnie, nie były etiolowane, chlorotyczne, zwiotczenie itp..

Możliwe jest prowadzenie eksperymentów na ciętych częściach roślin zanurzonych w wodzie, w roztworze składników odżywczych, a także na oddzielnych liściach umieszczonych w roztworze benzimidazolu.

Metody inokulacji roślin są dość różnorodne i zależą od biologii grzyba i roli infekcji w patogenezie choroby, a także od celów badania (sprawdzenie patogeniczności szczepów, ocena odporności odmian itp.). Rozważ szereg technik szczepienia, które są dość dobrze przetestowane i mogą być zalecane w praktyce..

Zaszczepianie roślin może być przeprowadzane zarówno przez patogen wyhodowany na sztucznej pożywce, jak i przez naturalną populację zarodników grzybów. W zależności od zadania stosuje się różne inokulum - grzybnię, zarodniki zebrane z jednej odmiany rośliny żywicielskiej lub reprezentujące populację geograficzną itp..

Wybierając metodę inokulacji, bierze się pod uwagę wydajność pracy, ponieważ często oceniane są tysiące odmian. Metody i czas sztucznej infekcji jak najbardziej zbliżony do naturalnego. We wszystkich przypadkach tworzone są warunki optymalne dla wzrostu patogenu (temperatura, wilgotność). Liczba zaszczepionych roślin powinna wynosić co najmniej 10 przy obowiązkowej kontroli.

Szereg chorób (zakurzone kłosy pszenicy i jęczmienia, żyta sporyszu, helminthosporiosis jęczmienia i owsa, żółta rdza pszenicy itp.) Charakteryzuje penetracja infekcji przez kwiaty i jajniki. W tym przypadku inokulację przeprowadza się przez zastosowanie suchych zarodników lub zawiesiny zarodników grzybów w kwiatach i jajnikach. Na przykład M.K. Khokhryakov (1969) wskazuje, że najprostszą metodą zaszczepienia pszenicy i jęczmienia pyłem smutnym jest rozpylanie chlamydosporów czynników wywołujących chorobę podczas kwitnienia zbóż z worków z gazy lub przecinania dotkniętych uszu.

V.I. Krivchenko (1963) zmodyfikował próżniową metodę inokulacji pszenicy patogenem smut za pomocą specjalnego urządzenia składającego się z cylindra, w którym umieszczane są kłosy pozostające na winorośli. Ten cylinder ma dwie rury wylotowe, z których jedna jest podłączona do pomp, a druga służy do dostarczania powietrza. Od dołu, poprzez specjalną próżniową zatyczkę i wąż, dostarczana jest zawiesina zarodników (0,2 g zarodników na 0,5 l wody). Istotą tej metody jest to, że podczas wypompowywania z cylindra za pomocą uszu powietrza wchodzi tam woda z zarodnikami. Po dostarczeniu powietrza zawieszenie przepływa z powrotem do statku. Aby uzyskać wiarygodne dane, wystarczy zainfekować 6-10 uszu jednej odmiany, a przy ocenie rodzin i linii mieszańców co najmniej trzy uszy.

E. E. Geshele (1964) dzieli metody inokulacji smut smut na dwie grupy: indywidualne zakażenie kwiatów i całego ucha. W pierwszym przypadku jeden górny i dwa dolne kłoski są cięte nożyczkami, a środkowe kwiaty są usuwane za pomocą pincety. Następnie każdy kwiat jest otwierany i zarodniki są wprowadzane za pomocą pincety. Ta metoda ma wiele modyfikacji. W szczególności możesz zainfekować kwiat specjalną pipetą z gruszką. W drugim przypadku materiał zawierający początek zakaźnego smutku nakłada się na zdrowe ucho po uprzednim nacięciu na poziomie zęba kolczastego.

Kwiaty jęczmienia zaszczepia się konidiami wywołującymi czynnik wywołujący pasożytniczą robaczycę przy użyciu urządzenia próżniowego w okresie, gdy kolec jeszcze nie opuścił rurki, tylko wierzchołki markizy.

Kwiaty roślin owocowych zakaża się grzybami z rodzaju Monilinia, nakładając suche konidia zwilżonym końcem igły na piętno tłuczka. Następnie kwiaty spryskuje się wodą z butelki z rozpylaczem i kładzie na nich gazowy izolator namoczony w wodzie, który jest pokryty folią z tworzywa sztucznego na jeden dzień. Ponadto w regionach południowych zaszczepione kwiatostany są niejasne - robią to samo, gdy są zarażone uszami.

Zaszczepione gałęzie owocowe są izolowane w taki sam sposób jak kwiaty. Jeśli eksperymenty przeprowadzane są na ciętych pędach, to po nałożeniu infekcji na liście, pędy umieszcza się w wilgotnych komorach wykonanych ze szklanych czapek wyłożonych od wewnątrz mokrą bibułą filtracyjną na 24 godziny w optymalnej temperaturze.

Gdy na liście, łodygi i inne organy roślin stosuje się czynniki zakaźne, z reguły stosuje się zawiesinę zarodników patogenów (konidiów). Powłoka woskowa na powierzchni liścia utrudnia penetrację grzybów, dlatego usuwa się ją przed zaszczepieniem, umożliwiając liście przejście między mokrymi palcami. Materiał zawierający infekcję z reguły nakłada się na spód arkusza w postaci kropli wodnej zawiesiny z aerozolu lub pocierać inokulum po arkuszu skalpelem. Czasami stosuje się suche zarodniki, które nanosi się na zwilżone liście sterylną szczotką..

W celu sztucznego zakażenia liści bezpośrednio na roślinach można zastosować wilgotne komory o małej objętości w postaci celofanowych kubków (o średnicy 20 mm) prasowanych wzdłuż krawędzi sprężystą sprężystą (metoda M. S. Dunina).

Zaszczepione rośliny na określony czas (12, 24, 48 godzin) umieszcza się w wilgotnej komorze, aby zapewnić bardziej kompletną infekcję. W polu osiąga się to przez zastosowanie zawiesiny zarodników w pochmurne dni lub wieczorem, szczególnie jeśli spodziewana jest rosa.

Materiał zakaźny rdzy zbożowej jest zwykle przygotowywany na dwie godziny przed zastosowaniem na rośliny. Aby to zrobić, weź 200-300 dotkniętych liści, zanurz je w wodzie (0,5-1 l) i zmyj z nich uredospory. Około 150 litrów zawiesiny wydaje się na 150-200 m2 siewu (L.F. Rusakov, 1926). W warunkach stacjonarnych inokulum przygotowuje się wcześniej w szklarni lub na specjalnych uprawach. W celu zakażenia działek - dystrybutorów rdzy należy pobrać 5 mg uredosporu na 1 m2, rozpylając je razem z talkiem w stosunku 1:30 lub 1: 100. Przy ciągłym zaszczepianiu na 1 m2 zużywa się 2 mg żywych uredosporów w przypadku późniejszego powlekania roślin folią i 20 mg bez mokrej komory (K. M. Stepanov, 1966).

Sztuczne zakażanie roślin rdzawymi podstawnikami (na przykład liniowymi lub brązowymi) odbywa się w wilgotnej komorze. Części roślin z rozwiniętymi teletosporami są pobierane i umieszczane nad zaszczepioną rośliną w taki sposób, że w miarę dojrzewania basidiospory spadają na jej powierzchnię.

Istnieją doniesienia o możliwości zaszczepienia patogenów pyriculariasis i mączniaka prawdziwego pojedynczymi liśćmi zbóż umieszczonymi w wilgotnych komorach, a także małe kółka żywych liści (o średnicy 12-14 mm) tytoniu z grzybem Peronospora tabacinale. Jednocześnie umieszcza się je na płytkach Petriego, których spód jest wyłożony trzema warstwami bibuły filtracyjnej nasyconej bez nadmiaru roztworem odżywczym o następującym składzie (wg na 100 ml wody): winian potasu i sodu (KOSO - CHON - CHON - COONa) - 0,5- K2NRO4 - 0,1 - KNO3 - 2,0 - Co (N03) 2 - 0,06 - KCl - 0,03 - MnO4 - 0,001 i Mg04 - 0,5 (Isard, 1960).

Na przykład podczas badania obowiązkowych pasożytów gatunków drzew stosuje się specjalne metody. Podczas pracy z grzybami wokalumetycznymi, które powodują deformację owoców i gałęzi, pędy z oznakami uszkodzenia wycięte z chorych drzew umieszcza się w naczyniach z wodą, aby zamknąć askospory, które są pokryte szeroką szklaną czapką. Pod krawędzią okapu znajdują się uszczelki o wysokości około 10 cm zapewniające dostęp powietrza. Po 1-2 dniach na dotkniętych narządach pojawia się torbiel zarodnikowanie grzyba. Utworzone askospory są przenoszone sterylnym skalpelem do eksperymentalnych zdrowych roślin, jajników lub pasm, które zaczynają się rozwijać. Jednocześnie wymuszane są skale, a także inne specjalne techniki, oparte na biologii patogenów, celach eksperymentu i możliwości infekcji przenikającej w określonych warunkach (Geshele, 1971).

Podczas pracy z czynnikiem sprawczym aschitozy grochu, zgodnie z metodologią Państwowej Komisji ds. Badań Odmian, inokulum uzyskuje się w probówkach na skośnym agarze. Z jednej probówki kultury grzybowej przygotowuje się zawiesinę, wstrząsając nią w 1 litrze wody. Ponadto średnio w jednej kropli płynu powinno znajdować się 40-50 konidiów patogenu. Zużywa się 2 l zawiesiny na 1 m2 siewu.

Nasiona można zaszczepiać na sucho lub mokro. Zanieczyszczenie nasion jest praktykowane podczas badania twardego pyłu pszenicy. Jednocześnie zużywa się 1 kg nasion na 1 kg zarodników, w zależności od przewidywanych warunków pogodowych podczas siewu i w nadchodzących dniach. Gdy pogoda nie sprzyja rozsypaniu się brudu, zwiększa się obciążenie infekcyjne. Za optymalne warunki uważa się temperaturę gleby na głębokości nasion 6 -10 ° C. Jeśli mają być badane małe partie nasion, są one zapylane nadmierną ilością zarodników i przepuszczane przez sito. Aby stworzyć niezbędny ładunek zakaźny, nasiona jęczmienia i owsa należy usunąć z folii, a E. E. Geshele (1964) zaleca usunięcie tylko tej części filmu, która pokrywa zarodek. W innych przypadkach nasiona są rozrzucone cienką warstwą na gęstej powierzchni, spryskane zawiesiną zarodników, przechowywane w wilgotnej komorze. Nasiona jęczmienia i owsa są również skutecznie inokulowane smutkiem przez zanurzenie w zawiesinie zarodników. Na 100 g nasion przygotowuje się 100 cm3 zawiesiny z 4-10 g zarodników. Nasiona trzymano w zawiesinie przez 15 minut, dokładnie wstrząsając mieszaniną trzy razy. Następnie nasiona umieszcza się w workach z gazy, pozostawia do spuszczenia z wodą i inkubuje przez 24 godziny w 20 ° C. Po wysuszeniu nasiona wysiewa się.

Nasiona owsa, które są zanieczyszczone trznadelami, z usuniętymi filmami, kiełkują w skrzynkach przy wilgotności gleby 25 i temperaturze 20 ° С. Po pojawieniu się są przeszczepiane na pole. Ta sama metoda E. E. Geshele (1964) zaleca stosowanie w przypadku sztucznego zakażenia jęczmienia smutkiem i patogenem robaka pasożytniczego.

Podczas inokulacji (shtambov) drzew owocowych na korze po 1-1,5 cm, stosuje się dwa poprzeczne nacięcia, między którymi kora jest cięta w środku w kierunku wzdłużnym, zginając skrzydła, wykonując kilka płytkich cięć drzewnych i wprowadzając badaną kulturę patogenu wraz z kawałkiem podłoża agarowego. Następnie płaty korowe są zamykane, a miejsce zakażenia jest pokryte folią lub pergaminem, zabezpieczając krawędzie sznurkiem lub taśmą klejącą. Podczas używania papieru pod opatrunkiem umieszcza się zwilżony kawałek waty..

W przypadku infekcji gałęzi szkieletowych patogenami, które mogą rozwijać się tylko w uprzednio osłabionych tkankach, te ostatnie są kauteryzowane w pobliżu miejsca zaszczepienia.

W przypadku sztucznej infekcji gatunków drzew fakultatywnymi pasożytami (grzybami z rodzaju Cytospora i inne.) eksperymenty najlepiej wykonywać w warunkach laboratoryjnych na pędach ciętych. W tym celu wycinane są pędy zdrewniałe o długości 150 mm i grubości około 10 mm w ilości 20 sztuk z odmiany testowej. (10 sztuk za doświadczenie i kontrolę). Następnie w odległości 50 mm od wierzchołka pędu wykonuje się cięcie do głębokości 5 mm - po sterylizacji powierzchniowej umieszcza się w nim podłoże agarowe z grzybnią. Miejsce zaszczepienia jest zaciśnięte folią plastikową, która jest przymocowana do krawędzi za pomocą nici lub taśmy izolacyjnej. Po drugiej stronie pędu pod folię umieszcza się bawełnę, która w razie potrzeby jest okresowo zwilżana przez wstrzyknięcie strzykawki przez folię.

Sadzonki umieszcza się w szklankach z wodą lub wstępnie kalcynowanym mokrym piaskiem. Będąc w wodzie lub piasku, sadzonki zaczynają brakować minerałów gleby, ich funkcje życiowe słabną i umierają. Proces ten zajmuje dużo czasu, co pozwala określić czas choroby sadzonek o różnym stopniu osłabienia, a zatem patogenną zdolność grzyba i odporność roślin.

Zainfekowane pędy porównuje się z kontrolą, stosując kryterium porządkowe X, zwykle w chwili śmierci 2/3 sadzonek najbardziej podatnej odmiany. W przypadku, gdy wzmocnione tworzenie kalusa przejdzie wzdłuż krawędzi rany, rana jest czyszczona i wykonuje się wtórne zaszczepienie bez przerywania eksperymentu.

Sadzonki drzew można zaszczepić wprowadzając infekcję do łodygi za pomocą strzykawki lekarskiej. Możesz zrobić zakaźny początek w korzeniach bezpośrednio w glebie, uszkadzając je metalowym prętem (zarodniki patogenu są wprowadzane do powstałej rany).

Zaszczepianie owoców i roślin okopowych odbywa się poprzez nałożenie zawiesiny zarodników patogenów na ich sterylną powierzchnię. W takim przypadku można również użyć suchych zarodników, przekłuwając lub nacinając skórę płodu lub wstrzykując wodną zawiesinę zarodników (1 kropla) za pomocą strzykawki pod skórą. Czasami infekcja jest wprowadzana do głębokiego cięcia rośliny okopowej, a następnie umieszczana jest w pierwotnym miejscu.

Najczęściej inokulum nakłada się na glebę, aby stworzyć zakaźne tło bez uszkodzenia systemów korzeniowych - grzyb najpierw rozmnaża się na specjalnych mediach.

Przez wiele lat pracy z szeroką gamą gatunków i odmian roślin stosuje się różne zakaźne tła. Mogą być naturalne i sztuczne, a także różnić się stopniem manifestacji choroby (słaba, silna).

Tworząc zakaźne podłoże w glebie, na przykład czynniki powodujące więdnięcie bawełny, czyste kultury grzybowe najpierw hoduje się w kolbach ze sterylnymi ziarnami owsa (100 ziaren na 100 cm3 wody). Następnie kultury rozmnaża się w butelkach z pożywką o tym samym składzie. Na każde 100 m2 powierzchni stosuje się 3-4 kg kultury (inna metoda została opisana poniżej).

Wprowadzanie kultur grzybowych do gleby jest również stosowane podczas pracy z patogenami więdnięcia (więdnięcia) bakłażana i pieprzu - sklerocja patogenów jest stosowana podczas pączkowania roślin ze wstępnym uszkodzeniem korzeni.

Przeprowadza się inokulację sadzonek jęczmienia i pszenicy czynnikami wywołującymi robactwo pasożytnicze, fusarium, ophiobolez i inne patogeny, wprowadzając hodowlę grzybów w rzędach nasion wraz z nasionami. Stosuje się czyste kultury grzybów hodowanych na ziarnach lub podłożach agarowych (0,5 skrobi, 0,02 KH2P04, 0,02 Ca (N03) 2 0,02 peptonu i 2 agarowych agar). Używana jest również zainfekowana sekcja słomy. Rzędy podczas siewu pokrywane są zarażoną słomą w ilości 20 pokruszonych roślin zmieszanych z 1 kg próchnicy na 25 m rzędu siewu (E. E. Geshele, 1964).

Podczas tworzenia zakaźnego tła patogenów pleśni śnieżnej mieszanka szczepów (Fusarium nivale, Typhula incarnata itp.), które są wstępnie uprawiane na zakwaszonym agarze ziemniaczanym, a następnie rozmnażane na sterylnym owsie. Przed wprowadzeniem kultury grzybów do gleby są one mieszane z ziemią w równych ilościach i równomiernie rozmieszczone na powierzchni działki. Zakażenie wprowadza się jesienią do gleby w ilości 200 g kultury na owsie na 1 m2. Zanieczyszczoną glebę pokrywa się od góry warstwą ziemi o grubości 1-1,5 cm W pierwszym roku na tle zakaźnym odbywa się siew rozpoznawczy. Jeśli w tym samym czasie wydalanie rośliny przez patogeny jest równomierne, w następnym roku wykres jest wykorzystywany do eksperymentów (V.K. Neofitova, N.A. Novik, 1969).

Zakaźne tło rdzy lnu lnianego (Melampsora lini) tworzyć za pomocą słomy linczu, na którą wpływa czynnik wywołujący chorobę (mieszanka odmian). Taka słoma (łodygi) układana jest jesienią pod śniegiem. Wiosną dotknięte łodygi są trzymane w wodzie przez 2-3 godziny i sprawdzane jest kiełkowanie teletosporów, kiełkując je na 50-100 segmentach łodyg w wilgotnej komorze. Kiełkujące zarodniki zlicza się 48 godzin po umieszczeniu w wilgotnej komorze.

Pierwsza metoda ma zastosowanie w badaniach biologii patogenu i inokulacji pojedynczych roślin, druga - w ocenie odmian.

Podczas tworzenia zakaźnego (prowokującego) tła czynnika wywołującego wiltylinę bawełny wertykalnej na pierwszym poletku w pierwszym roku szczątki roślin dotknięte grzybem (guza-pai) pachną i obficie podlewają glebę. W następnym roku przeprowadza się siew wyrównujący odmiany bawełny podatnej na tę chorobę, po zbiorach dotknięte resztkami roślin ponownie pachną. Siew wyrównawczy jest również konieczny, aby sprawdzić wiarygodność prowokującego tła. Dopiero po takiej weryfikacji można go uznać za przygotowany do testowania odmian.

Infekcja lnu antracnozą (Colototrichum lini) przeprowadzone przez wprowadzenie infekcji do gleby i opryskanie sadzonek zawiesiną zarodników. Jako materiał zakaźny stosuje się dotkniętą słomę lnianą i sadzonki, a także czystą kulturę patogenną uprawianą na owsie i agarze z brzeczki. Aby zainfekować glebę, czysta kultura grzybowa, chore sadzonki i słoma lniana są osadzone w glebie. Rośliny wegetatywne zaszczepia się zawiesiną zarodników w fazie sadzonkowej (T.V. Krylova, Yu. T. Karpunina, 1969).

Po zakażeniu białą zgnilizną słonecznika (Sclerotinia liBertiana) stosuje metodę, w której równocześnie z nasionami wprowadza się 2-3 małe sklerocje czynnika sprawczego patogenu chorobowego do każdego gniazda za pomocą ręcznej maszyny do sadzenia. Określona metoda pozwala uzyskać objawy choroby w dolnej części łodygi (A. I. Lukashevich, 1969).

Wzrost zapasu mączniaka słonecznika (Plasmopara helianthi) są przeprowadzane w następujący sposób. Najpierw przygotowuje się zawiesinę zoospor, dla której dotknięte liście i warstwę mokrej bibuły filtracyjnej umieszcza się w mokrych komorach. Mokre komory są przechowywane w temperaturze 16-20 ° C. Dojrzałe konidia usuwa się z powierzchni liści za pomocą żyletki lub mokrego wacika i przygotowuje się zawiesinę. Zaszczepianie roślin odbywa się przez utrzymywanie zawiesiny lepkich nasion w zawiesinie przez 5-8 godzin w temperaturze 17–19 ° C. Następnie sadzonki słonecznika sadzi się w skrzyniach o wymiarach 50 × 40 × 15 cm, szklarniach lub otwartym terenie. W skrzynkach i siedliskach rośliny umieszcza się zgodnie ze schematem: między rzędami 10-15, w rzędzie 2-3 cm - w otwartym terenie - między rzędami 45-60 i w rzędzie 3-5 cm.

Czynnik sprawczy koniczyny twardzinowej jest uprawiany ze sklerocji na plastry ziemniaków w wilgotnej komorze. Następnie plastry z rozwiniętą grzybnią pasożytniczą umieszcza się pod roślinami na szyjce korzenia.

W podobny sposób wzrost liczby zakażeń w glebie osiąga się poprzez wielokrotne wprowadzanie resztek roślin zakażonych patogenami mączniaka rzekomego słonecznika, zgnilizny korzeni i korzeni pszenicy i jęczmienia, stępki, kapusty, askochitozy grochu itp..

Patogeny glebowe (grzyby porodowe Verticillium, Fusarium itp.) uprawy owoców i jagód rozmnaża się w czystych kulturach na pożywce. Zazwyczaj ziarna zbóż stosuje się jako substrat odżywczy, który wlewa się wodę do kolb (w przybliżeniu w stosunku 1: 1) i sterylizuje w autoklawie pod ciśnieniem 1 atm. Następnie zakażenie odpowiedniego grzyba wprowadza się do kolb z ziarnem i inkubuje przez 10-15 dni z okresowym wytrząsaniem w celu zmieszania substratu. W tym samym czasie nasiona nagich zbóż (pszenica, żyto, rośliny strączkowe) są mieszane z plewami lub drobno posiekaną słomą, aby uniknąć tworzenia się mulistej masy..

Dawki nanoszenia takiej kultury grzybowej w glebie różnią się w zależności od rodzaju patogenu i odmiany roślin. Jako wsparcie można przyjąć, że 3 kg kultury należy zastosować na 120 m2 plantacji jagodowych lub 1,5-2 kg na obszar żerowania jednego drzewa (w zależności od schematu sadzenia).

Tak więc powyższe metody inokulacji roślin są bardzo różnorodne, z pewnymi zmianami mają one zastosowanie do pracy z prawie wszystkimi fitopatogennymi grzybami na wielu różnych roślinach rolniczych..