Metody diagnostyczne chorób wirusowych i wirusoidalnych roślin

Wizualna metoda diagnostyczna

W większości przypadków nie jest trudne określenie wirusowego charakteru choroby. Zwykle jest to określane przez zewnętrzne znaki, takie jak liniowe wzory chlorotyczne lub wzory pierścieniowe na młodych liściach. Jednak ich identyfikacja jest często trudna, ponieważ wirusy mają bezobjawowy (utajony) charakter rozwoju. Objawy zależą od stanu organizmu, agresywności szczepu patogenu, warunków środowiskowych i czasu przebywania wirusa lub wiroidu w komórkach gospodarza. Na przykład objawy choroby są wyraźnie wyrażone u roślin rosnących w jasnym świetle i przy umiarkowanej temperaturze, w wysokiej temperaturze i przy słabym oświetleniu, objawy choroby mogą w ogóle nie być wyrażone.

Wyjaśnienie żył najmłodszych liści jest często jednym z pierwszych objawów ogólnoustrojowej infekcji wirusowej. Żyły stają się żółte i półprzezroczyste. Liście, które tworzą się później, mogą być mozaikowe, nakrapiane lub całkowicie żółte (chlorotyczne)..

Okres inkubacji choroby zależy od rodzaju wirusa, rośliny żywicielskiej i warunków środowiskowych, ale w każdym przypadku jest to kilka dni lub tygodni.

Jeśli pierwsze objawy wirusozy są zauważalne na sadzonkach, wówczas źródłem infekcji były nasiona lub infekcja nastąpiła przez nosiciela. Jeśli zainfekowane rośliny zostaną umieszczone w hodowli całkowicie przypadkowo lub tylko w rzędach posadzonych z tej samej partii, oznacza to, że materiał do sadzenia najprawdopodobniej został zainfekowany. Jeśli na niektórych obszarach pola zostaną znalezione chore rośliny, a pojawienie się zainfekowanych obszarów wynika z różnic w glebie, istnieją wszelkie powody, aby zakładać rozprzestrzenianie się wirusów w glebie.

Należy również zauważyć, że istnieją objawy charakterystyczne dla wirusozy, ale spowodowane przez inne przyczyny (zmiany spowodowane przez fitoplazmy, niektóre bakterie i ssące szkodniki). Objawy podobne do infekcji wirusowej są często spowodowane zaburzeniami odżywiania minerałów, takimi jak te związane z niedoborem żelaza (rys. 1) Regulatory wzrostu i herbicydy różnego rodzaju mogą powodować różne deformacje narządów (rys. 2)).

Tak więc, stosując metodę diagnostyki wizualnej, niemożliwa jest dokładna identyfikacja za pomocą zewnętrznych oznak uszkodzenia przez wirusy i wiroidy, jasną odpowiedź można uzyskać tylko przy użyciu metod instrumentalnych (test immunoenzymatyczny, analiza PCR itp.).

Metoda roślin wskaźnikowych

Metoda roślin wskaźnikowych - Jest to bardzo popularna metoda diagnozowania chorób wirusowych i wirusoidowych oraz identyfikacji ich patogenów. Metoda rośliny wskaźnikowej oparta jest na zastosowaniu roślin wskaźnikowych, które w większości przypadków dają wyraźne i specyficzne objawy charakterystyczne dla określonego rodzaju patogenu. Rośliny wskaźnikowe zioła są zakażane mechanicznym zaszczepieniem sokiem, w wyniku czego infekcja może objawiać się miejscową martwicą, odbarwieniem i zahamowaniem wzrostu.

W przypadku wirusa aspermii pomidorowej młode rośliny tytoniu stosuje się jako wskaźnik (Nicotiana glutinosa), w diagnostyce wirusa X ziemniaka - amarant kulisty (Gomphrena globosa) Aby wykryć infekcję pomidorów wiroidami, bulwy ziemniaka w kształcie wrzeciona wykorzystują skopolię jako wskaźniki (Scopolia sinensis) lub wrażliwych odmian pomidorów. W niektórych przypadkach pojedyncze izolowane liście roślin wskaźnikowych można wykorzystać do zakażenia. Wirusy tolerujące sok są szczepione na rośliny wskaźnikowe różnymi metodami. W rzadkich przypadkach do przenoszenia wirusa stosuje się nosicieli owadów i rośliny pasożyta.

Metoda diagnostyczna serologiczna

Metoda opiera się na reakcji wytrącania (powstawania osadu) między specyficznymi przeciwciałami i białkami (antygenami) patogenu. Metoda diagnostyki serologicznej nie ma zastosowania do identyfikacji wiroidów z powodu braku składnika białkowego, a także w przypadku wielu wirusów nietolerujących soków o słabych właściwościach immunogennych. Do identyfikacji wirusów w roślinie można zastosować następujące modyfikacje diagnostyki serologicznej:

1) Test immunoenzymatyczny (ELISA) - najbardziej wrażliwa metoda, która pozwala uzyskać oszacowania ilościowe. Opiera się na swoistym rozpoznawaniu antygenów powierzchniowych wirusa przez przeciwciała w obecności enzymów. Ta metoda jest szeroko stosowana w praktyce do identyfikacji wirusów uprawnych, odpowiednich do seryjnych analiz.

2) Metoda kroplowa. Przeprowadza się to w następujący sposób. Na szklanym szkiełku kropla soku roślinnego jest mieszana z kroplą surowicy odpornościowej. Po kilku minutach reakcję ocenia się pod mikroskopem przy małym powiększeniu w ciemnym polu lub nawet wizualnie, bez mikroskopu.

3) Metoda podwójnej dyfuzji - przeprowadzane w żelu agarowym w celu określenia sferycznych i innych małych wirusów. Przeprowadza się tę metodą w niektórych studzienkach, które są cięte w warstwie podłoża agarowego, dodaje się surowicę odpornościową, a w innych - oczyszczony sok roślinny. W żelu cząsteczki wirusa i przeciwciała dyfundują ze sobą, aby się spotkać, aw miejscu spotkania tworzą wyraźne linie precypitacji w przypadku ich uzupełniającej się swoistości.

4) Metoda immunodyfuzji promieniowej. Stosując tę ​​metodę, surowicę odpornościową dodaje się bezpośrednio do podłoża agarowego, podczas gdy studzienki są wypełnione sokiem roślinnym. Reakcja jest pozytywna, jeśli wokół dołków powstają osady w kształcie pierścienia..

5) Metoda adsorpcji. Metoda opiera się na fakcie, że przed reakcją z antygenem przeciwciała wiążą pewien obojętny materiał z dużymi cząsteczkami, na przykład lateksem. Podczas reakcji z antygenem dochodzi do wyraźnie widocznej aglutynacji całego kompleksu..

Metoda mikroskopii elektronowej

Na ultracienkich skrawkach chorych tkanek roślinnych za pomocą mikroskopów elektronowych można określić strukturę, kształt, a nawet rozmiar wirusów lub wiroidów. Mikroskop elektronowy jest często stosowany w połączeniu z metodami serologicznymi (mikroskop immunoelektroniczny) i można wykryć cząsteczki wirusa z warstwowymi przeciwciałami. Metodę mikroskopii elektronowej stosuje się niezwykle rzadko ze względu na wysoki koszt sprzętu i odczynników, trudność w izolacji wirusów i wiroidów, utlenianie sekcji roślin oraz szereg innych czynników.

Metoda elektroforezy

Metoda ta polega na rozdzieleniu uprzednio oczyszczonych kwasów nukleinowych wirusa (wiroidu) lub jego białek w żelu pod wpływem prądu elektrycznego, a następnie barwieniu stref. Metoda elektroforezy pozwala określić masę i rozmiar struktur wirusowych lub wiroidowych. Metoda jest szeroko stosowana do wizualnego badania końcowego produktu reakcji łańcuchowej polimerazy. Aby zapisać wyniki, rób zdjęcia żelu w świetle przechodzącym lub odbitym.

Molekularne metody biologiczne opierają się na wiedzy o strukturze cząsteczki RNA (DNA) wirusa lub wiroidu. Najczęstszym testem jest amplifikacja (namnażanie) specyficznych gatunkowo sekwencji RNA podczas reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR). Poszczególne fragmenty RNA izolowane z badanych roślin, które są specyficzne tylko dla jednego gatunku lub rodzaju wirusów, są mnożone przez enzymy w obecności starterów (odpowiadających oligonukleotydów). Co więcej, ich liczba w końcowym produkcie reakcji przekracza miliony razy początkową liczbę kopii wybranego fragmentu RNA. Następnie wirusowy RNA (DNA) jest wykrywany za pomocą elektroforezy żelowej lub immunofluorescencji. Metoda jest szeroko stosowana w praktycznych badaniach wirusologicznych..

Metoda sondy DNA opiera się również na zasadzie komplementarności kwasów nukleinowych. Zsyntetyzowane są specyficzne sondy, które hybrydyzują tylko ze specyficznymi sekwencjami nukleotydowymi wirusa lub wirusowego RNA. W zależności od wyboru sond możliwe jest rozróżnienie grup, typów, a nawet szczepów wirusów i wiroidów.

Metoda włączenia

Po rozwoju wirusów w komórkach roślinnych tworzą się skupiska cząstek wirusowych (inkluzje) zwane kryształami Iwanowskiego, które są widoczne za pomocą konwencjonalnego mikroskopu świetlnego. Każdy wirus ma własną formę wtrąceń wirusowych, które najczęściej powstają w komórkach naskórka liści lub w komórkach włosów. Na przykład wirus mozaiki tytoniu ma sześciokątne i igiełkowe kryształy - wirus X ziemniaka zazwyczaj tworzy sferyczne amorficzne ciała. W celu wykrycia wirusa mozaiki ogórkowej z zieloną plamką, skręcania liści ziemniaka i niektórych innych stosuje się chemiczne metody diagnostyczne..